Официальный сайт Хитон-ЮГ
Как поймать льва в пустыне
Главная » Статьи » Биохимия и лабораторная диагностика

Определение эффективности ифа тест-ситемы для определения уровня антител к вирусу гвк-1

Кузнецов Д.П., Перепечаев К.А., Уласов В.И., Кузнецова С.В.
Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, г.Щелково, Московской области

Источник: материалы XVI Московского международного конгресса по болезням мелких домашних животных

Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность является действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. ИФА позволяет определять уровень антител как в сыворотке крови, так и во внутриглазной, спинномозговой жидкостях и даже в молоке, что необходимо при проведении любых научных и научно-практических исследований. С помощью ИФА можно проводить контроль эффективности вакцин и иммунных сывороток, определять напряженность иммунитета, что позволяет оценить степень защиты животных от заражения и заболевания. Метод также чрезвычайно удобен для выявления вирусного антигена в смывах и соскобах со слизистой оболочки глаз, ротовой и носовой полостей.

Для подтверждения эффективности тест-системы изучали несколько важных критериев – таких как воспроизводимость, чувствительность и специфичность.

В тесте на воспроизводимость использовались 5 планшетов для ИФА, сенсибилизированных вирусом ГВК-1. Высокоактивная, средне – и низко активные положительные сыворотки проверялись на 30 из 96-ти лунок каждого из 5-ти планшетов. Данные были собраны по 15-ти планшетам и проанализированы. Коэффициент вариации и показатель степени адсорбции образца к среднему значению степени адсорбции положительной и отрицательной контрольных сывороток были определены для оценки внутри - и межпланшетной воспроизводимости. Среди лунок (Таблица 1) величина вариации составила от 3 до 6%. Для определения специфических антител на планшетах вариация составила около 4%. Вариация между отдельными планшетами была менее 4% для любой сыворотки и незначительно отличалась между отдельными лунками.

Таблица 1.

Результаты теста на воспроизводимость

Вариабельность от лунки к лунке

Активность сыв.

Планшет - 1

Планшет - 2

Планшет - 3

Планшет - 4

Планшет - 5

Среднее

Высоко

4.34%

6.11%

5.30%

4.12%

2.81%

4.54%

Средне

4.86%

3.88%

8.26%

4.78%

4.07%

5.17%

Низкая

4.69%

5.08%

5.70%

4.87%

4.88%

5.04%

Общее среднее = 4.85%

Вариабельность от плашки к плашке

о/п значения

Активность сыв

Планшет - 1

Планшет - 2

Планшет - 3

Планшет - 4

Планшет - 5

Среднее

Высоко

1.906

1.985

1.857

1.961

2.009

1.944

Средне

0.923

1.007

0.946

0.997

0.993

0.973

Низкая

0.319

0.359

0.316

0.342

0.342

0.336

 

Средняя вариация = 3.34%

При определении чувствительности тест-системы планшеты были сенсибилизированы антигеном ГВК-1 в рабочей концентрации. Высокоактивная анти-ГВК-1 сыворотка была разбавлена нормальной сывороткой кошки в соотношении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. Эта сыворотка была раститрована методом двойных разведений и протестирована в ИФА на 5 микропланшетах и в РН

(Рис. 1). Как видно из результатов титрования метод ИФА позволяет обнаружить антитела к ГВК-1 в положительных сыворотках разведенных нормальной 1:32 и 1:64; в РН – только 1:2 – 1:16.

Результаты исследования анти-ГВК-1 сыворотки в РН и ИФА

 

Рис. 1. Результаты исследования анти-ГВК-1 сыворотки в РН и ИФА.

При определении чувствительности разработанной тест-системы методом ИФА было исследовано 63 сыворотки кошек, полученных из пунктов передержки бездомных животных и из ветеринарных клиник г. Москвы. Все сыворотки параллельно исследовали в реакции вируснейтрализации (Таблица 2).

Таблица 2

Исследование сывороток к вирусу ГВК-1 в РН и ИФА

Количество сывороток

Титр в РН*

Титр в ИФА*

7

0

0

12

0

200

9

2 - 4

400

15

4 - 16

400 – 800

14

16 - 32

800 – 1600

6

32 - 64

3200 – 6400

Итого: 63

Примечание *: представлены данные обратные значениям титров РН и ИФА

Сравнительные исследования 63 сывороток кошек в ИФА и в РН показали, что 7 сывороток были отрицательны в обеих реакциях, 12 сывороток имели в ИФА титр 1:200 и были отрицательными в РН, 44 исследуемые сыворотки были позитивны в РН и ИФА.

Для выражения количества антител к вирусу герпеса кошек в условных единицах (УЕ) вычисляли отношение разности значений оптической плотности (ОП) каждого образца и среднего значения ОП нормальной контрольной сыворотки к разности среднего значения адсорбции позитивного контроля (Сп) и среднего значения адсорбции нормальной контрольной (Сн) сыворотки, которое умножали на 100 (Maggs DJ, Lappin MR, Nasisse MP: 1999/ Использовали следующую формулу:

УЕ = (ОП образца – средняя ОП Сн) / (средняя ОП Сп – средняя ОП Сн) Х 100

Пример вычисления:
ОП позитивной контрольной сыворотки (Сп) – 1,218, 1,284. 
Среднее значение ОП Сп = (1,218+ 1,284)/2 = 1,251
ОП нормальной контрольной сыворотки (Сн) – 0,088, 0,094
Среднее значение ОП Сн = (0,088 + 0,094)/2 = 0,091
(средняя ОП Сп – средняя ОП Сн) - откорректированный позитивный контроль: 1,251 - 0,091 = 1,160
Расчет количества антител к вирусу герпеса кошек в образце в УЕ:
ОП образца – 0,784
УЕ = (0,784 – 0,091)/1,160 Х 100 = 59,7 УЕ

Интерпретация результатов анализа

Образцы сывороток, имеющие количество антител менее 10 УЕ считали отрицательными. Образцы сывороток, имеющие количество антител более 25 УЕ считали позитивными. Сомнительными считали пробы, количество антител в которых лежало в диапазоне от 10 до 25 УЕ. Этот уровень антител может быть обусловлен начальной стадией заболевания. В этом случае диагноз может быть подтвержден или опровергнут, если при исследовании парных сывороток, отобранных с интервалом 2 – 3 недели после первого исследования, отмечается увеличение уровня антител в пробе более 25 УЕ. При выражении количества антител к вирусу ГВК-1 в УЕ в исследовании 63 сывороток кошек в ИФА были получены следующие результаты: 24 образца сыворотоки были отрицательными, 3 образца были сомнительными и 36 образцов положительными (Таблица 3).

Таблица 3.

Выражение количества антител к вирусу ГВК-1 в УЕ в ИФА

Количество сывороток

Количество антител в УЕ

24

менее 10

3

от 10 до 25

36

более 25

Итого: 63

Таким образом, в результате проведенных исследований были получены компоненты для определении уровня антител к вирусу ГВК-1 методом ИФА, определены условия постановки реакции, показана воспроизводимость, чувствительность и специфичность разработанного теста.

Summary
Kouznetzov D.P.,Perepetcaev K.A.,Ulasov V.I.,Kouznetzova S.V. Determination of effectiveness ELISA test-system for calculation level antibodies of virus HVC-1. VNITIPB, Shelkovo, Moscow reg.

For confirmation effectivene test-system we study somewhat important criterions: reproduction, sensitivity and specific. It were receiving components for determination of level antibodies of virus HVC-1 the ELISA, determination conditions of reaction, evidence reproduction, sensitivity and specific development test

Категория: Биохимия и лабораторная диагностика | Добавил: timerlan2008 (23.12.2017)
Просмотров: 19 | Теги: Определение эффективности ифа тест- | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
avatar

 

Наши торговые марки

 

                       


ООО "ХИТОН-ЮГ"

О компании
Где купить?
Знак качества
Партнерам
Советы и статьи
Блог
Контакты





Каталог

Защита от блох и клещей
Защита от глистов
Уход за глазами
Уход за ушами
Косметика
Антибактериальные средства
Витаминно-минеральные
комплексы
Другие препараты


Для кошек

 

Шампуни
Средства от блох и клещей
Средства от глистов
Витамины и минералы

 

Полезная информация

Клещи у кошек и собак
Пироплазмоз

Для собак

Шампуни
Средства от блох и клещей
Средства от глистов
Витамины и минералы









Хитон-Юг © 2018 Все права защищены. г. Ставрополь, ул. Старомарьевское шоссе 28

8Индекс цитирования888 8 Анализ сайта 9Рейтинг@Mail.ru8 Яндекс.Метрика 88New Cell